Устранение экспериментальных отклонений при количественном анализе профилей метилирования ДНК посредством высокопроизводительного бисульфитного секвенирования и гибридизации на олигонуклеотидных ДНК-чипах

Количественный анализ профилей метилирования ДНК является неотъемлемым аспектом исследований в области эпигенетических механизмов онкогенеза. Кроме того, детекция опухолеспецифичных эпигенетических аномалий обладает высоким диагностическим потенциалом. При анализе генов-кандидатов, как правило, используют ПЦР-амплификацию модифицированных бисульфитом генных областей. Поскольку измерение степени метилирования CpG-динуклеотидов происходит в ампликонах, ПЦР определяет точность всего анализа. Избирательная амплификация форм ДНК, различающихся характером метилирования, может затруднять интерпретацию результатов. Дополнительные экспериментальные искажения могут быть связаны с особенностями технологий детекции метилированных оснований, например специфичностью олигонуклеотидных зондов ДНК-чипов. Целью работы было исследование применимости предложенного нами ранее алгоритма для устранения экспериментальных искажений из количественных данных метилирования ДНК, которые получены методами высокопроизводительного бисульфитного секвенирования и гибридизации на олигонуклеотидных ДНК-чипах. Материалы и методы. Для количественной характеристики профилей метилирования ДНК вблизи точек начала транскрипции генов-кандидатов использованы методы высокопроизводительного бисульфитного секвенирования по технологии 454 и гибридизации на ДНК-чипах «Febit Biotech». Регрессионный анализ полученных величин метилирования ДНК проводили посредством кубических полиномиальных кривых. Результаты. Для анализа были выбраны гены, аномальное гиперметилирование которых обнаруживается в злокачественных новообразованиях: кодирующие субъединицы фермента сукцинатдегидрогеназы SDH, а также онкосупрессоры CDKN2B, DAPK1 и TP53. Анализируемые регионы амплифицировали в контрольных пробах ДНК известной степени метилирования. Амплификация и последующее секвенирование ампликонов SDHB и SDHD выявили значительные отклонения от ожидаемых величин метилирования. Аналогично индексы метилирования рассмотренных CpG-динуклеотидов в генах CDKN2B и DAPK1 существенно искажались при гибридизации на ДНК-чипе. С помощью уравнений полученных кубических регрессионных кривых была проведена корректировка исходных данных с практически полным устранением артефактов. Выводы. Применение кубической полиномиальной регрессии для корректировки экспериментальных искажений в двух разных типах количественных данных метилирования ДНК - полученных высокопроизводительным бисульфитным секвенированием и гибридизацией на олигонуклеотидных ДНК-чипах - продемонстрировало практически полное устранение артефактов, и, следовательно, универсальность метода.

Читать в источнике